La biglietteria si trova in Piazza Leonardo da Vinci n. 26, affacciata su una delle vie di accesso principali al centro storico e facilmente raggiungibile per i visitatori.
Le prime sale sono allestite nella Palazzina Uzielli alla quale si accede attraversando la scenografica Piazza dei Guidi, spazio urbano riconfigurato dall'artista Mimmo Paladino e ispirato agli studi di Leonardo. La rimanenti sezioni espositive del Museo sono invece ospitate nelle suggestive stanze del Castello dei Conti Guidi l'edificio medievale simbolo della città di Vinci e storica sede della collezione.
Il percorso comprende poi la sezione "Leonardo e la Pittura" allestita presso la storica Villa del Ferrale a circa 1,5 km da Vinci e la Casa Natale di Leonardo ad Anchiano (3km da Vinci).